鼠辈的肠道干细胞与类器官培养体系构建

在该技术方案中，我们描述了分离、培养和维持小鼠肠干细胞作为隐窝绒毛器官的方法。这些从小肠或大肠分离的细胞将随着时间的推移保持自我更新和多系分化的潜力。

这为研究人员提供了培养野生型或转化型肠上皮的技术方案和体外检测组织干细胞动态平衡的方法。材料和试剂

CatalogueNo. PMG8043) Recombinant rat head protein 50 ng/ml recombinant human recombinant protein 1500 ng/ml recombinant mouse Wnt-3A 100 ng/ml 10mm nicotinamide (Sigma-aldridge,

移液管、吸液管和微量移液管、解剖钳和剪刀、5810R离心机（Eppendorf，型号：5810R）、明场倒置显微镜、4 C室中的桌面摇床、37 C、

5% co 2细胞培养箱的生物安全柜（组织培养柜）为了通过二氧化碳窒息杀死小鼠，必须根据实验室主办方批准的动物使用规定使用二氧化碳源、可调分配器和安乐死室。实验步骤

图一。从小鼠结肠或小肠中分离含有肠隐窝的干细胞的关键步骤概述第一部分：分离、培养、维持，

传代和保存a .分离和培养小肠器官的步骤（预计完成时间：2-3小时）1。二氧化碳窒息小鼠安乐死。2.15 cm近端小肠的解剖和切除。请注意不要用工具接触任何鼠标皮肤或毛发。

以防止微生物污染。解剖后，用10 ml注射器和21G针头用冷PBS清洗肠。3.用剪刀纵向切开肠，并将其放入装有25毫升冰冷PBS的50毫升锥形管中。翻转10到15次，倒出PBS，

并用25毫升冷PBS替换。重复该过程，直到上清液不再含有任何可见的碎片。4.将肠切成5毫米的小块，然后将其放入10毫升冷的5毫米EDTA-PBS中。在10毫升移液管中反复吹气15次，

研磨碎屑。让碎片在重力作用下沉淀30秒。5.吸出上清液，小心避开肠碎片，并将其替换为10ml 5mM EDTA-PBS，并将其放在4C的摇床上10分钟。6.重复步骤A5吸取上清液，

将其替换为10毫升5 mM EDTA-PBS，并将其放在4C的台式滚筒上30分钟。7.吸出上清液，轻轻加入10 ml冷PBS清洗隐窝并吸出。然后，加入10毫升冷PBS。

然后用10 ml移液管用力吹10次。8.在另一个试管中收集10 ml上清液部分。向隐窝中加入10 ml冷PBS，用力吹10次，然后将其收集在另一个试管中。再次重复步骤A7以收集总共三种馏分。

9.每份取10l，在显微镜下检查，以发现完整的肠隐窝，并确认没有大碎片绒毛。图2显示了从在Lgr5基因座具有GFP敲入等位基因的小鼠中分离的完整肠隐窝的例子（Barker等人，

2007）。

小肠隐窝显微照片

图二。具有Lgr5-GFP敲入等位基因隐窝的新鲜分离小肠的明场/荧光图像叠加（Barker等人，2007）。完整的隐窝用白色箭头标记，包含GFP（绿色）标记的Lgr5干细胞。

碎片（死细胞）用白色箭头标记。刻度为50微米。使用含有最多核的10毫升部分，

与10 ml基础培养基中的15 U/ml脱氧核糖核酸酶I混合（向10 ml基础培养基中添加30l），并通过100m过滤器过滤至涂有BSA（1%）的50ml离心管中；涂覆离心管，

加入1毫升1%牛血清白蛋白，用力摇晃并弃去液体。在管道上涂覆BSA可以防止凹槽被吸附到管道的侧面，从而提高产量。11.再次过滤溶液，这次通过70m过滤器进入BSA（1%）涂层试管。

然后将滤液在台式离心机中以300 xg离心5分钟。12.吸收上清液。取决于许多因素（动物饮食、收获时间和每个清洗步骤的严重程度），上清液中可能会积累一层粘液，有时接近细胞沉淀。泵送上清液将提高纯度，

但是，在真空抽吸的过程中，它也可以吸出细胞沉积物。在此步骤中应小心避免损失沉淀物，在此步骤中可使用10 ml移液管轻轻吸出上清液。13.用5 ml含5% FBS的基础培养基重悬细胞沉淀。

并以100 xg离心5分钟。14.吸取上清液，将细胞沉淀物重悬于200l基础培养基中，并吸取10l计数隐窝。你可能要先稀释它才能得到准确的数字。使悬浮在隐窝中的培养基体积最小化，

因为你要以1:10的比例混合100-1000个墓穴和基质胶。在典型的分离中，我们回收250个隐窝/微升（在基础培养基中），并将其与基质胶以1:10混合。

15.将40l Matrigel:crypt混合物以液滴形式接种到48孔板的孔中，注意不要让mat rigel接触孔的边缘（示意图见图3）。

尽管类有机物仍会在已经“坍塌”到井壁的基质胶中生长，但如果基质胶在钻孔中心保持单个圆顶，则更容易改变介质。将培养板置于37的培养箱中10-15分钟以聚合基质胶。

16.向每个孔中添加250l小肠器官生长培养基。在7-10天的过程中，活的肠干细胞应该形成具有隐窝绒毛结构的器官样结构（例如，参见图4）。

Schematic diagram of Matt riegel dome

图3。示意图显示40l“基质胶圆顶”正确放置在48孔板的孔底部。聚合后，将250l生长培养基添加到固体液滴顶部。确保基质胶不接触孔的边缘，更换培养基时，

将移液管放在孔的一侧。

小肠器官的明视野显微照片和细胞类型

图4。小肠器官的高分辨率明视野显微照片，结构中观察到的每个单细胞类型的示意图。刻度为50 m. B .保持培养、传代培养和冷冻保存小肠器官的步骤1。分离后，每两天更换一次小肠生长培养基。

2.生长5-7天后，或当器官样体显示出深色坏死核心时，需要传代。为此，除去生长培养基，向孔中加入500l冷PBS，并用移液管破碎基质胶，注意避免在重悬的混合物中形成气泡。

3.将重悬浮液转移至15 ml锥形管中。使用p200移液管，液体上下移动50至100次，以机械方式将类器官体破碎成更小的碎片。完成后，向混合物中加入7 ml冷PBS并上下吹20次。

4.在台式离心机中以200 xg离心5分钟。5.小心吸出上清液，注意不要去除细胞团。肉眼可能看不到细胞群。如果只通过一个孔，可能看不到特别的细胞群。将沉淀物悬浮在基质胶中，

将每孔40l重新接种到48孔板中。对于非转化的器官培养物，我们通常以1: 4的比例进行分配。6.如果细胞要保存在液氮中，请将沉淀物重新悬浮在含有10% FBS和10% DMSO的基础培养基中。

让它在-80C的冰箱中缓慢冷冻，然后将其移至液氮中无限期保存。第二部分是大肠器官的分离、培养、维护、传代和冷冻保存。a .分离和培养大肠器官的步骤1。老鼠安乐死。

2.解剖并切开近端大肠5-7厘米。请注意不要用工具接触任何老鼠皮肤或毛发，以防止微生物污染。解剖后，用冷PBS洗涤肠腔。3.用剪刀纵向切开结肠。用载玻片轻轻刮肠腔，清除粪便和粘液。

将其放入含有25毫升冰冷PBS的50毫升锥形管中。将其倒置10至15次，吸出PBS并加入25 ml冰冷的PBS。重复该过程，直到上清液不再含有任何可见的碎片。4.将肠切成5毫米的块，

然后将其放入10毫升冷的5mM EDTA-PBS中。用10毫升移液管用力吹15次以研磨碎片。让碎片在重力作用下沉淀30秒。5.吸出上清液，小心避开肠碎片，并使用10毫升，

取而代之的是5 mM EDTA-PBS，并将其放在4的摇床上15分钟。6.从试管中吸出EDTA-PBS。用PBS洗两次。然后加入3毫升含有500 u/ml胶原酶IV的基础培养基。

用5毫升移液管上下吹5次。将其放入37的水浴中30分钟。7.加入10毫升冰冷的PBS，然后用10毫升移液管用力吹10次。8.在另一个试管中收集10 ml上清液部分。

向隐窝中加入10毫升冷PBS，用力吹10次，然后将其收集在另一个试管中。再次重复B7步骤，收集总共三种馏分。9.将每种组分各取10l吸收到载玻片上，在显微镜下观察是否存在完整的结肠隐窝。

10.将含有15 U/ml脱氧核糖核酸酶I的10 ml基础培养基添加到含有最多凹坑的10 ml级分中，然后通过100m过滤器过滤到涂有BSA（1%）的50 ml离心管中。为了涂覆离心管，

请用移液管将1毫升1%牛血清白蛋白溶液移入离心管，并剧烈摇晃。在管道上涂覆BSA可以防止凹槽被吸附到管道的侧面，从而提高产量。11.再次过滤溶液，

这次，它通过70m过滤器进入涂有BSA（1%）的离心管，然后在台式离心机中以300 xg离心5分钟。12.吸出上清液。取决于各种因素（动物饮食、收获时间和每个清洗步骤的执行程度），

上清液中可能有一层粘液积聚，有时在细胞沉淀附近。抽吸会提高产量的纯度，但在真空抽吸过程中也会吸走细胞沉积物。请小心避免在此步骤中丢失细胞团。你可以试着用10毫升的吸管吸取这里的上清液。

或者使用p1000移液器。13.用5 ml含5% FBS的基础培养基重悬细胞沉淀，并以100 xg离心5分钟。14.将细胞沉淀悬浮于200l基础培养基中，吸取10l样品对隐窝进行计数（见图5）。

你可能必须先稀释它才能得到准确的计数。尽可能保持中等体积的重悬穴，因为您的目标是以1:10的比例混合100-1，000个穴。在典型的分离中，

我们将重新悬浮50个结肠隐窝/l基础培养基，并将其与基质胶以1:10混合。15.将40l重新悬浮的混合物以气泡的形式涂在48孔板的底部，注意不要让基质胶接触到孔的边缘（见图3）。

将该板置于37的培养箱中，让Matrigel聚合10-15分钟。16. 向每个孔中添加250l大肠类器官生长培养基。

图5.在第二部分的步骤A14中，从200l结肠隐窝的重悬中取出10l等分试样的明场图像。比例尺为50m。B. 结肠类器官的维持，传代和低温保存本部分的操作与结肠类器官的描述完全相同，

小肠类器官也是如此。知识点笔记

我们通常测试2或3批Matrigel，并保留大量性能最好的批次。为了进行大量测试，我们将新鲜分离的干细胞接种到Matrigel中，观察两周后的生长情况，包括一次传代。

产生R-spondin1和Wnt3a的细胞系可以用于配置条件培养基，从而大大降低了成本。Noggin通常以100 ng/ml的最终浓度添加到肠干细胞培养基中，

但是我们发现50 ng/ml足以支持正常的干细胞生长，分化和自我更新。可以将所有商业购买的生长因子溶解在0.1BSA-PBS中，并以浓缩储液的形式储存在-20C下。

当准备IV型胶原酶（用于结肠类器官分离）时，在开始前制作10倍新鲜储备液。粉末是静态的，因此将其放在一块铝箔上称重，并放入15 ml锥形管中，添加基础培养基以达到正确的浓度，

并通过涡旋或在37C下孵育确保全部溶解在溶液中。然后通过0.45m过滤器进行过滤灭菌。可以将10MRho激酶抑制剂Y-27632添加到生长培养基中，以增加类器官生长的产量，

尽管我们通常不使用该抑制剂来分离和生长类器官。结肠类器官应在分离后4-6天开始以大空心球的形式生长，请注意，这比小肠干细胞生长的通常观察到的时间更长。培养基配方

肠道基础培养基500 ml advaned DMEM F/12 添加2 mM L-谷氨酰胺100单位/ml青霉素，1,000g/ml链霉素1 mM N-乙酰半胱氨酸10 mM HEPES

小肠类器官生长培养基向基础培养基中添加重组鼠EGF 50 ng/ml重组鼠Noggin 50 ng/ml重组人R-Spondin-1 500 ng/ml

大肠类器官生长培养基向基础培养基补充重组鼠EGF 50 ng/ml重组鼠Noggin 50 ng/ml重组人R-Spondin-1 500 ng/ml重组鼠Wnt-3A 100 ng/ml10 mM烟酰胺